الكروماتوغرافيا 5

يحوي الشاي Tea نسبة متفاوتة من الكافئين Caffeine بحسب نوعه. حيث تكون هذه النسبة هي الأعلى في الشاي الأسود Black Tea.

سنصف هنا كيف نستخلص الكافئين على مرحلتين، أولاهما استخلاصها من منقوع الشاي بتنائي كلوروالميثان Dichloromethane (CH2Cl2) (كلوريد المثيلين Methylene Chloride)، والثانية تنقية الخلاصة الجافة بكروماتوغرافيا العمود Column Chromatography. ومن الأفضل إذا كان هناك اثنان يجرون التجربة أن يقوم الأول بالاستخلاص بينما يهيئ الثاني عمود الكروماتوغرافيا.

المرحلة الأولى: استخلاص الكافئين من الشايCaffeine Extraction from Tea

أضف إلى قمع فصل Separatory Funnel حوالي 40 مل من منقوع للشاي، مع 20 مل من محلول حمض الهيدروكلوريك HCl 5%. استخلص هذا المزيج بدفعات من 4 × 10 مل من ثنائي كلوروالميثان. يكون ثنائي كلوروالميثان في الطبقة السفلى Lower Layer من قمع الفصل.

نجمع الـ 40 مل من ثنائي كلوروالميثان، ونجففها بكبريتات أو سلفات الصوديوم اللامائية Anhydrous Sodium Sulfate، لنزع أي ماء منه (مع أن ذلك ليس ضرورياً لأن السيليكا جل Silica Gel المستخدمة في عمود الكروماتوغرافيا يمكن أن تخلصنا من هذا الماء). رشح كبريتات الصوديوم على قطعة قطن. انقل السائل إلى دورق دائري القعر Round Bottom Flask وبخر المحلول بالمبخر الدوراني Rotovap.

بعد أن يتبخر السائل سيتبقى لك في الدورق مسحوق أبيض اللون هو الكافئين. لكن هذا الكافئين لا يكون نقياً، ولذلك نقوم بتنقيته بطريقة كروماتوغرافيا العمود.

المرحلة الثانية: تنقية الكافئين بكروماتوغرافيا العمود Caffeine Purification by Column Chromatography:

ضع قطعة قطن في أسفل عمود صغير ثم املأ العمود بحرص إلى ارتفاع حوالي 50 – 60% منه بالسيليكا جل المنقوعة بثنائي كلوروالميثان. أضف طبقة رقيقة من الرمل من الأعلى فوق السيليكا جل.

ستستخدم في هذه العملية محلولاً ساحباً (شاطفاً) Eluent متدرجاً Gradient. أي أنك ستبدل المحلول الساحب أثناء العملية، بادئاً بثنائي كلوروالميثان 100%، ثم بمزيج من ثنائي كلوروالميثان وخلات الإثيل 5:95% بالترتيب، ثم أخيراً بخلات الإثيل 100%.

حل الكافئين الصلب الذي حصلت عليه في المرحلة الأولى في 10 مل من أول محل ساحب (شاطف) أي ثنائي كلوروالميثان 100%، وضع المحلول في عمود الكروماتوغرافيا من الأعلى بحرص، مستقبلاً السائل من الأسفل في أنبوبي اختبار (5 مل في كل منهما)، ثم مرر 15 مل ثنائي كلوروالميثان 100%، واستقبلها من أسفل العمود في ثلاث أنابيب اختبار بحيث تجمع 5 مل في كل منها.

أضف بعد ذلك 10 مل من الطور الساحب ثنائي كلوروميثان وخلات الإثيل 5:95، واستقبل 5 مل منها في كل من أنبوبي اختبار. وأخيراً أضف 5 مل من خلات الإثيل100%، واستقبلها في أنبوب اختبار آخر.

ستحصل بهذا على 8 أنابيب اختبار يحوي كل منها على 5 مل سائل. أجر اختبار كروماتوغرافيا طبقة رقيقة Thin-Layer Chromatography (TLC)، للأنابيب مقارناً بمحلول قياسي Standard Solution للكافئين، مع استخدام طور ناقل ثنائي كلوروالميثان وخلات الإثيل 5:95، وكشف للبقع باستخدام اليود البلوري Crystalline Iodine.

أخيراً، انقل أجزاء السائل التي تحتوي الكافئين، إلى دورق مستدير القعر سبق وزنه، وبخر المحلول بالمبخر الدوار. زن الدورق واستخرج من الفرق كمية الكافئين التي حصلت عليها. وإذا كان لديك وزن الشاي الذي استخدم في الحصول على منقوع الشاي الذي استخدم في المرحلة الأولى، فإنه يمكن حساب نسبة الكافئين المستخلصة من الشاي في تجربتك.

عادة ما نستدل على نقاوة الكافئين الذي حصلنا عليه، بقياس درجة انصهارها. ولكن في حالتنا قد يتوجب علينا ترك الكافئين يجف أكثر بتركه في درج المخبر لمدة أسبوع مثلاً. درجة انصهار الكافئين اللامائي Anhydrous Caffeine بين 235-238 °م.

بوابة المعرفة

اقرأ المقال التالي عن الكروماتوغرافيا: أصول وتطور الكروماتوغرافيا السائلة