الكروماتوغرافيا 8

مم يتألف جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؟

هناك اختلاف في وصف المصادر المختلفة لمكونات جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography (HPLC)، ولكن في الحقيقة أن المكونات واحدة ولكن البعض يركز على عمل بعض هذه المكونات دون الأخرى.

تشمل المكونات الرئيسة في جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء الأقسام الخمسة التالية:

• خزان المحل (المذيب) Solvent Reservoir (الطور الناقل أو المتحرك Mobile Phase) أو الخزانات المتعددة.
• مضخة الضغط العالي High Pressure Pump، أو نظام إيصال المحل Solvent Delivery System.
• العمود Column.
• نظام الحقن Injector System، أو أداة إدخال العينة Sample Introduction Device.
• الكاشف Detector.

وهناك أيضاً من مكونات جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء أربعة أقسام إضافية هي:

• جهاز العمود اللاحق للعمود الأصلي Post-Column Apparatus.
• نظام جمع المعلومات وإخراجها Data Collection and Output System.
• معالجة السحب باستخدام بالكاشف اللاحق Post-Detector Eluent Processing.
• التوصيلات وأنابيب التوصيل Connective Tubing and Fittings

الطور المتحرك (المحل) في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC):

عادة ما يحتوى الطور المتحرك أو الناقل Mobile Phase (المحل أو المذيب Solvent) في حاوية أو وعاء من الزجاج Glass Reservoir. والطور المتحرك في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography (HPLC) هي عادة مزيج أو خليط Mixture من المكونات السائلة القطبية Polar Liquid Components وغير القطبية، التي تختلف تراكيزها Concentrations بالاعتماد على تركيب العينة Composition of Sample.

تشمل المحلات الشائعة أي مجموعة قابلة للمزج Miscible Combinations من الماء أو سوائل عضوية Organic Liquids متنوعة (الأكثر شيوعاً بينها الميثانول Methanol والأسيتونتريل Acetonitrile). وقد يحتوي الماء على محلول موقي أو بفر Buffers أو أملاح Salts تساعد على فصل مكونات عينة التحليل Separation of the Analyte Compounds، أو مركبات مثل حمض ثلاثي فلوروالأسيتيك Trifluoroacetic Acid الذي يعمل كعامل اقتران أيوني أو شاردي Ion Pairing Agent.

يتم ترشيح Filtration الطور المتحرك تحت الضغط عبر ورقة ترشيح ناعمة جداً، ويتم نزع الغازات منه قبل الاستعمال أو في الجهاز، وينقل إلى جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء باستخدام مضخة ميكانيكية Mechanical Pump عبر توصيلات خاصة حتى العمود Column.

المضخات في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)

لم يستعمل تعبير الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography أو الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط High Pressure Liquid Chromatography، إلا بعد أن استخدمت المضخات لنقل الطور المتحرك Mobile Phase (المحل Solvent) من خزانه إلى العمود الكروماتوغرافي Chromatographic Column عام 1972م.

تدفع المضخات بالطور المتحرك باتجاه عمود الجهاز وكاشفه Detector. وبحسب عدد من العوامل مثل أبعاد Dimentions العمود، وحجم دقائق Particle Size الطور الثابت Stationary Phase في العمود، وسرعة التدفق Flow Rate، وتركيب الطور المتحرك، يمكن استخدام ضغط تشغيلي Operating Pressure باستطاعة Capacity أو أداء تؤمن سرعة تدفق ثابتة Consistent وقابلة لإعادة الانتاج Reproducible، تصل إلى 42 مليون باسكال MPa (حوالي 6000 psi أو حوالي 400 ضغط جوي Atmospheres).

والأجهزة الحديثة أصبح بإمكانها العمل بشكل أفضل تحت ضغط أعلى بكثير، بحيث أصبح بالإمكان استخدام حجم دقائق في الأعمدة دون 2 ميكرومتر، تدعى الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء UPLC. فالضغط أصبح فيها بحدود 100 MPa أو 1000 ضغط جوي.

هناك عدد من أنواع المضخات التي تستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة “عالية الضغط”، يمكن أن تصنف بأربعة أنواع هي: مضخة ضغط غازي مباشر Direct Gas Pressure Pump، ومضخة تكثيف هوائية Pneumatic Intensifier Pump، ومضخة ترددية Reciprocating Pump، ومضخات محقنية Syringe Pumps.

ولكن في أيامنا هذه يستخدم فقط نوعان من المضخات في أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، أحدهما هو مضخة مسيطر عليها ميكانيكياَ Mechanical Controlled، توصل الطور المتحرك بسرعة تدفق ثابتة، والثانية مضخة مسيطر عليها هوائياً تزود وتعمل تحت ضغط ثابت.

في المضخات الميكانيكية، المستخدم الأكثر فيها نموذج المكبس الترددي، التي يقوم فيها محرك أو آلية ميكانيكية بسوق غطاس من الياقوت Sapphire Plunger في غرفة نهاية سائل صغيرة لتحريك الطور المتحرك. وفي نفس الوقت، تسيطر صمامات اختبار على تدفق المحل عند مدخل ومخرج نهاية السائلـ مما يمنع تدفق السائل إلى الخلف.

وبسبب التدفق المستمر بواسطة نبضات الغطاس المتحركة باستمرار داخلاً وخارجاً، فإنه ينشأ من هذه الحركات إمكانية تقلب للضغط Pressure Fluctuation، الذي يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع خط الأساس Upset Base Line أثناء التحليل.

أما في حالة المضخات الهوائية، فيمكن إما لنموذج إزاحة الغاز Gas Displacement Type الذي يستخدم الضغط المباشر لإجبار المحل على الخروج من أنبوب، نموذج المضخم الهوائي Pneumatic Amplifier Type الذي يضغط الغاز بضغط أقل ارتفاعاً باصطدامات على النهاية الواسعة للمكبس لإجبار النهاية الأصغر على إطلاق السائل. ويكون تضخيم الضغط متناسباً مع النسبة بين مساحتي النهايتين في طرفي المكبس.

محقن العينة في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)

يستخدم المحقن أو الحاقن Injector في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء HPLC لحقن مكونات العينة Sample Components بالشكل السائل (أو الغازي) إلى حجرة العمود التي تسمح يمزجه (خلطه) Mixing مع الطور المتحرك أو الناقل Mobile Phase فتجري معه ليتم الكشف عنها.

هناك نوعان من المحاقن، أحدها المحقن اليدوي Manual Injector، الذي يستخدم صمامات حقن Injection Valves (ويدعى محقن ريوداين Rheodyne Injector)، وأما الثاني فهو أداة حقن آلية بشكل كامل مسيطر عليها الكترونياً Fully Automated Electronically Controlled Device.

يعمل المحقن اليدوي بتحميل العينة بواسطة حِقَن أو سيرنجات زجاجي أو بلاستيكي Glass or Plastic Syringes أثناء ضغط الطور المتحرك إلى العمود. وتكون حجوم العينات النموذجية ما بين 5 و 20 ميكرولتر. ويجب أن يتحمل المحقن الضغط العالي للنظام السائل في الجهاز.

أما في حالة المحقن الآلي الذي يستخدم عند وجود عينات عديدة للتحليل، بحيث يكون الحقن اليدوي غير عملي، فإن جهازاً يضبط عدداً من الحقنات بشكل آلي بشكل متسلسل، بحيث يكون حجم الحقنات والزمن بين الحقنات يضمن إعادة إنتاج الحقنات بنفس الشكل. ويمكن في المحقن الآلي أن يعدل حجم الحقنات في أي وقت تبعاً لمتطلبات التحليل، إذ يكون الحجم ما بين 0.1 و 100 مل.

أعمدة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)

يمثل العمود Column قلب أي جهاز للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography (HPLC). والطور الثابت Stationary Phase الموجود في العمود هو المسؤول عن الفصل المناسب Adequate Separation لمكونات العينة Sample Ingredients.

تعتمد فعالية الفصل على عوامل منها القطر الداخلي للعمود Column Inner Diameter (في أغلب الأعمدة 4.6 مم، ولكنه يمكن أن يكون أقل من ذلك)، وطول العمود Length (كثير من الأعمدة بطول 25 سم، ولكن يمكن أن يكون أقصر من ذلك)، ونوع الدقائق Particle Type المكونة لمادة تعبئة العمود Column Packing Material (وهي من السيليكا Silica، أو من البوليمرات Polymers حسب غرض وطريقة الاستخدام)، وحجم هذه الدقائق Particle Size (الأكثر استخداماً منها في التحليل الكمي التقليدي بحجم 5 ميكرومتر µm، ولكن يمكن أن تكون أصغر من ذلك أو أكبر في التطبيقات الأخرى).

بالاعتماد على التطبيق المرغوب، هناك عدد كبير من أعمدة الكروماتوغرافيا السائلة عالية وفائقة الأداء عند الشركات المصنعة للأجهزة. وكل نوع من الأعمدة أو مواد تعبئتها يدعم آلية فصل Separation Mechanisms مختلفة.

يوجد مواد خاصة بأنواع عمليات الكروماتوغرافيا السائلة، مثل كروماتوغرافيا الطور العادي Normal Phase Chromatography، وكروماتوغرافيا الطور المعكوس Reversed Phase C.، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم Size Exclusion C.، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (الشاردي) Ion Exchange C.، وكروماتوغرافيا الإلفة Affinity C.، والكروماتوغرافيا الكيرالية Chiral C.، وغيرها.

الكواشف في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)

الكاشف Detector هو جزء هام من أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid Chromatography (HPLC). ويوجد الكاشف في الجزء الخلفي للعمود Column ومهمته تحليل المواد المنفصلة بواسطة العمود وتسجيل زمن خروجها وكميتها أولاً بأول.

يقوم الكاشف بإدراك التغيرات في تركيب المحلول المسحوب Eluent، ويحول المعلومة إلى إشارة كهربائية Electrical Signal تقيم بواسطة حاسوب Computer.

وهناك عدد كبير من أنواع الكواشف التي تستعمل في أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة عالية وفائقة الأداء، بطرق مختلفة معتمدة على المزايا البنيوية Structural Characteristics للمادة المحللة Analyte. ومن أهم هذه الكواشف كاشف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية UV/VIS-Spectroscopy، وكاشف معامل الانكسار Refractive Index Detector (RI)، وكاشف التألق Fluorescence Detector، والكاشف الكهروكيميائي Electrochemical Detector، والكاشف الطيفي الكتلي Mass-Spectrometric Detector.

معالجة البيانات في الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء:

عندما تتم عملية الكشف Detection في جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء High Performance Liquid K Chromatography (HPLC) تسجل المعلومات بشكل إشارات كهربائية Electronic Signals، يتم تضخيمها بواسط مضخم Amplifier، ثم تسجل بشكل كروماتوغرام Chromatogram، على هيئة نقاط بينات Data Points. ويتم تفسير هذه المعلومات يدوياً أو في حاسوب Computer، حتى يحصل على تنسيق قابل للعرض.

يدعى هذا نظام البيانات Data System. وعند استخدام الحاسوب، تكون مهمته أيضاً الرقابة على جميع مكونات جهاز  الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، ويحدد زمن السحب Elution Time زمن الاحتجاز Retention Time، لمكونات العينة (ما يسمى التحليل الكيفي Qualitative Analysis) وأيضاً كمية العينة (ما يسمى التحليل الكمي Quantitative Analysis).

بوابة المعرفة